Kultury in vitro roslin - rozmnazanie klonalne

Podział metod rozmnażania klonalnego

Istnieje kilka sposobów rozmnażania klonalnego, a kryterium ich podziału stanowią predyspozycje poszczególnych jednostek rozwojowych rośliny( takich jak komórki, tkanki, organy) do różnicowania pąków przybyszowych ,zarodków
Somatycznych oraz możliwość pobudzania do wzrostu pąków bocznych.
W związku z tym wyróżnia się kilka możliwości, w jakich może zostać zapoczątkowane rozmnażanie wegetatywne roślin in vitro:

1. Powstawanie zarodków somatycznych z komórek ,tkanek i organów

Zarodki somatyczne ( embroidy) mogą powstawać na kilka sposobów:

• Bezpośrednio z komórek epidermalnych lub subepidermalnych eksplantatu, np. Citrus , Ranunculus, Daucus
• W komórkach powierzchniowej strefy tkanki kalusowej rozrastającej się z eksplantatu
• W hodowlach pojedynczych komórek parenchymatycznych , np. Macleya, Atropa i in.

Zarodki somatyczne to proste struktury dwubiegunowe, powstają wskutek podziałów mitotycznych , z pojedynczych komórek inicjalnych.cechy tych komórek to :
 Gęsta cytoplazma
 Duże jądro
 Plastydy z ziarnami skrobi
 Liczne rybosomy
 Liczne sferosomy
 Gęsta sieć plasmodesm łącząca je z sąsiednimi komórkami (siec ulega przerwaniu w trakcie rozwoju zarodków )
Rozwój tych zarodków przebiega w podobny sposób jak zarodków zygotycznych rozwijających się w woreczku zalążkowym. Zarodki somatyczne jednak mniej precyzyjnie powielają schemat podziałów komórkowych podczas wczesnych stadiów rozwojowych.
Embriogeneza przebiega za pośrednictwem tkanki kalusowej rozrastającej się z eksplantatu inicjalnego pod wpływem następujących stymulatorów
1. 2,4 – D
2. związków azotowych ,najczęściej w formie NH4NO3
3. substancje typu mleczka kokosowego, hydrolizatu kazeiny lub specyficzne zespoły aminokwasów
pasażowanie odbywa się na pożywkę bez 2,4 –D; zmiana konsystencji pożywki oraz wprowadzenie cytokininy stymuluje dalsze różnicowanie się kultur zarodkowych

zdolność do embriogenezy maleje progresywnie w kolejnych hodowlach, dlatego też liczba pasaży ma istotne znaczenie dla rozmnażania tą metodą.
Zalety metody : szybka i efektywna ( w przeciągu miesiąca z 1 g kalusa można uzyskać 500 zarodków Daucus carota). Rośliny uzyskane z zarodków zazwyczaj utrzymują genotyp rośliny matecznej
Wady metody :zarodki somatyczne mogą być formowane tylko przez niektóre gatunki należące do rodzin: Umbelliferae, Solanacae, Cruciferae. W większości przypadków konieczne byó izolowanie ekspalntów z bardzo młodych organów.

2. Różnicowanie się pąków przybyszowych w hodowlach tkanki kalusowej

W miejscu zranienia eksplantatu , po wprowadzeniu do jego pożywki regulatorów wzrostu z grupy auksyn i cytokinin, odróżnicowują się żywe i nieuszkodzone komórki. Tworzą one tzw. tkankę kalusową o charakterze parenchymatycznym, której komórki, dzielą się intensywnie, podejmując w ten sposób funkcje komórek merystematycznych.
Substancje wzrostowe w trakcie powstawania kalusa oddziałują w specyficzny sposób:
 Przyspieszają podziały komórkowe
 Stymulują wydłużanie się komórek ( poprzez rozluźnienie struktury ściany i ułatwienie przenikania wody)
 Uaktywniają proces różnicowania i organogenezy

Auksyny najczęściej stosowane Auksyny stosowane
do stymulowania wzrostu tkanki kalusowej to : rzadziej to:
-IAA = kwas indolilo-3-octowy -IBA =kwas indolilo-3-masłowy
-NAA= kwas naftylo-1-octowy -BNOA=kw. Naftoksy-2-octowy
-2,4-D=kw. 2,4-dwuchlorofenoksyoctowy -BTOA=kw.2-beznylotiazolilooctowy
2,4,5-T =kw.2,4,5trojchlorofenoksyoctowy

Substancje z grupy giberelin nie zostały dokładnie zbadane pod katem ich wpływu na proces tworzenia się kalusa ; wiadomo jednak ,że GA3 hamuje powstawanie tkanki kalusowej roślin jednoliściennych.


1. oddzielenie zespołu komórek kalusa do eksplantatu inicjalnego
2. przeniesienie kalusa na pożywkę z dodatkiem auksyny lub bez niej powodują
przyspieszenie wzrostu
tk.kalusowej
kalus może być zachowany przez nieograniczenie długi okres , poprzez dzielenie go i pasażowanie na świeżą pożywkę co 4 tyg.

Krótka charakterystyka tkanki kalusowej

1. Czynniki istotne w ocenie i charakterystyce kalusa:
-barwa
- struktura
- konsystencja
2. Budowa zróżnicowana pod względem wielkości i kształtu (od kom. izodiametrycznych po luźno związane komórki olbrzymie)
3. Budowa tkanki zdeterminowana budową tkanki inicjalnej , składem pożywki oraz wiekiem hodowli
4. w kalusie obecne są komórki poliploidalne
a) Może to być skutkiem endopoliploidyzacji ( występuje wiele komórek o zmienionej liczbie chromosomów, uczestniczących w powstaniu kalusa i wpływających na jego poliploidalność)

b) Może to być skutkiem selektywnego działania cytokinin ( przyspieszają one podział komórek ,wywołując niekiedy zaburzenia w funkcjonowaniu wrzeciona kariokinetycznego , co wpływa na powstawanie komórek poliploidalnych)

c) Obecność komórek poliploidalnych ,może sprzyjać rozwijaniu się roślin o cechach niekorzystnych( ale znaczna ilość gatunków zachowuje charakter diploidalny)

5. zdolność do organogenezy tkanki kalusowej obniża się w miarę kolejnych pasaży







Proces różnicowania się tkanki kalusowej:

• Formowanie się elementów trachealnych
• Formowanie się wiązek przewodzących
• Zakładanie się gniazd i pasm tkanki merystematycznej, z której rozwijają się wierzchołki wzrostu pędów i korzeni

Wpływ na organogeneze mają:
- kinetyna i auksyna ( równowaga ilościowa między nimi decyduje o kierunku zmian )
- nieorganiczne fosforany
- hydrolizat kazeiny
- tyrozyna
- niektóre związki fenolowe sprzyjające inaktywacji auksyny
- kwas abscyzynowy (ABA) wprowadzony na miejsce kinetyny
- pasażowanie kalusa z pożywki zestalonej na płynna
- wystawienie tkanki na światło o dużym natężeniu

Powstawanie pąków przybyszowych :
 Nie powstały przez wierzchołek pędu ,ale
- egzogenicznie - endogenicznie
[ na powierzchni kalusa] [w głębi tkanki]
 Mają strukturę jednobiegunową i są połączone waskularnie z tkanką macierzystą
 Pędy rozwijające się z pąków przybyszowych oddzielonych od kalusa, wymagają ukorzenienia na świeżej pożywce z dodatkiem jednej z auksyn : NAA, IAA, IBA

Zalety metody : metoda nadaje się do rozmnażania wszystkich gatunków roślin z dowolnie wybranego eksplantatu;jest szybka i wydajna
Wady metody: pędy otrzymane z tkanki kalusowej mogą mieć zmienioną podstawową liczbę chromosomów lub być chimerami.


3. Różnicowanie się pąków przybyszowych bez pośrednictwa tkanki kalusowej

Uwolnienie komórki spod regulujących wpływów całego organizmu staje się dla komórki sygnałem do odróżnicowania się tej komórki ,bedącej częścią dojrzałej taknki. Może się to odbywac na dwóch drogach :
- izolacja organu lub jego fragmentu od rośliny matecznej
- pod wpływem stymulacji przez substancje wzrostowe

Komórka odróznicowana dzieli się intensywnie powstają centra merystematyczne


Wierzchołek pędu wierzchołek korzeni


*zjawisko wykorzystane do rozmnażania Begonia, Saintpaulia, Streptocarpus, Peperomia z sadzonek liściowych

W specyficznych warunkach in vitro wzrost i różnicowanie się pąków przybyszowych bez pośrednictwa tkanki kalusowej może przebiegać ze zwielokrotnioną intensywnością, anekiedy nie wymaga to nawet stymulacji syntetycznymi regulatorami wzrostu ( Heloniopsis)

Badano jednakże wpływ syntetycznych regulatorów wzrostu na zapoczątkowanie i przebieg organogenezy bezpośrednio w tkankach eksplantatów , używając do tego celu wybranych modeli :

- całych liści
- Fragmentów blaszki środkowej
- eksplantatów epidermalnych izolowanych z liści
- łodyg i kwiatostanów
Na podstawie tych badań wysnuto następujące wnioski :
 Wykazano przydatnośc cytokinin BAP lub 2iP do indukowania pąków przybyszowych w tkankach liści Begonia ( stęż. 10 – 10 mol/ dm 3)
 W eksplantantach epidermalnych z liścia Begonia : pąki rozwijały się pod wpływem 2ip lub zeatyny , zaś korzenie pod wpływem NAA przy współdziałaniu z zeatyna
 Od obecności kinetyny i dodatku IAA zależało indukowanie pąków przybyszowych w eksplantantach epidermalnych z łodyg Nicotiana tabacum
 Kwas giberelinowy GA3 hamował owstawanie pąków pędowych i korzeni w liściach Begonia rex
 Wyłącznie auksyny( IAA oraz IBA) stymulowały organogenezę w kulturach łusek cebul Hyacintus, zaś NAA działał hamująco
 Cytokininy nie wywierały żadnego wpływu na powstawanie cebul przybyszowych , a GA3 wyraźnie hamował ich różnicowanie
Cecha stałą dla każdego gatunku było usytuowanie wyspecjalizowanych komórek, zdolnych do przekształcania się w kom. merystematyczne .
Heloniopsis:
W eksplantantach izolowanych z blaszki liścia paki przybyszowe rozwijały się
1) z komórek powierzchniowej warstwy parenchymy położonej nad wiązką przewodzącą
2) zawiązki korzeni powstawały w tkankach głębiej położonych ,takich jak floem lub komórki miękiszu bezpośrednio otaczające wiązkę przewodzącą
Begonia
1)centra merystematyczne były tworzone wył. Przez komórki epidermy usytuowane w bezpośrednim sąsiedztwie komórki bazalnej włoska wydzielniczego
2)paki przybyszowe rozwijały się nad wiązką przewodzącą , w proksymalnej części eksplantatu i były skierowane wyłącznie do ogonka liściowego

Co ciekawe, w niewielkich ekspalntatach epidermalnych (3x5 mm powierzchni),składających się głownie z epidermy i 3,4 warstw niżej położonych komórek subepidermalnych , stwierdzono obecnośc komórek zdolnych do odróżnicowania się w centra merystematyczne, z których rozwinęły się pąki przybyszowe: Nautilocalyx, Saintpaulia, Brassica, Catharanthus, Solanum, Torenia, Nicotiana, Chrysanthemum

Zalety metody : rośliny uzyskane ta metoda ,zawieraja genotyp rośliny matecznej. Metoda może służyć do wykazania zdolności regeneracyjnych na b. niewielkich skrawkach epidermy oraz określania wpływu różnych czynników na powstawanie pąków pędowych ,kwiatowych i zawiązków korzeni
Wady metody : przydatna do rozmnażania niewielu gatunków

4.Rozwój pąków bocznych w hodowlach wierzchołków pędów

1. budowa wierzchołka pędu
- merystem wierzchołkowy
- 2 lub 3 zawiązki liści
- Kilka pąków bocznych - po izolowaniu i wyożeniu na pożywkę rozwija się w pojed.roslinę





2. dominacja wierzchołkowa

Jest to fizjologiczna współzależność między pąkiem głównym a pąkami bocznymi; wierzchołek wytwarza endogenna auksyne ,która jest transportowana do korzeni, hamując wzrost paków bocznych .
3. czynniki stymulujące rozwój paków bocznych w hodowli merystemów wierzchołkowych:

-. wprowadzenie do pożywki cytokinin w wysokich stęz. Niweluje mechanizm korelacyjnego hamowania wzrostu pąków bocznych pod wpływem auksyny
- wysokie stężenie soli mineralnych w pożywce  zakłocenie równowagi czynników pobudzających wzrost paków( prze nadmiar składników pokarmowych )
- wstrząsanie (rotacja) hodowli w płynnej pożywce  zmiana biegunowości tkanek (przez rotację)i ograniczenie dopływu tlenu(w płynnej pożywce)


4. niekorzystne skutki stosowania stymulacji:
- dezorganizacja wzrostu pąków bocznych  rozwój pędów staśmionych ,silnie skróconych, o zdeformowanym ,szeregowo ułożonym ulistnieniu
- nasilenie tendencji do zmienności ,zwł. gdy powstanie pędów zachodzi za pośrednictwem tkanki kalusowej

* metoda znalazła zastosow. w rozmnażaniu klonalnym Orchidaceae, Chrysanthemum, Gloxinia, Funkia, Nicotiana i in..

Wyodrębniono dwie metody badawcze:
Stymulowanie całego wierzchołka pędu do tworzenia kalusa przez dodanie auksyn do pożywki Bezpośrednie indukowanie rozwoju pąków bocznych za pomocą cytokinin w wysokich dawkach
- uzyskanie kalusa  seria podziałów tkanki 
Pobudzenie wzrostu pąków bocznych
- Proliferacja licznych pędów rozdzielanie pędów, skracanie ich i umieszczenie na świeżej pożywce indukowanie kolejnych przyrostów

Zalety metody : przydatna do szybkiego rozmnażania roślin przez hodowle wierzchołków pędów,a klony roślinne są równe fenotypowo i wykazują genetyczna stabilność.

Wady metody : rzadkie przypadki mutacji roślin uzyskanych ta metodą( tylko u gat. U których stwierdzono, że ich odmiany uprawne były chimerami peryklinalnymi, lub gdy pędy rozwijały się za pośrednictwem tkanki kalusowej)

5. Rozwój pąków bocznych w hodowlach fragmentów pędów i innych eksplantatów

1. sadzonkowanie in vitro
pęd dzieli się na niewielkie fragmenty ( z węzłem,para liści i pakiem bocznym); z paków bocznych pod wpływem cięcia oraz regulatorów wzrostu dodanych do pożywki rozwijaja się kolejne pędy ( jest to sadzonkowanie in vitro)

2. zastosowanie metody
w rozmnażaniu roślin uzyskanych in vitro z hodowli merystemów wierzchołkowych lub z paków bocznych różnicujących się w tkance kalusowej

3. zasada metody
a)stymulowanie rozwoju paków bocznych znajdujących się na pędach , które rozwinęliy się in vitro,np.:Dianthus, Chrysanthemum, Asparagus officinalis, Dioscorea, Fragaria ananassa
b) pobudzanie pąków do rozwoju bezpośrednio z uprawianych roślin np. :
- fragm. Łodygi Olea europea
- młode pędy Eucalyptus,Mnihot
- Głąbiki Brassica oleraceae
- fragm. Kosyczków kwiatowych roślin z rodziny Compositae

*Najlepiej metodę sadzonkowania ilustruje schemat rozmnażania klonalnego Asparagus officinalis
 tutaj czynnikiem wystarczającym do stymulowania wzrostu jest cięcie i pasażowanie eksplantatu inicjalnego, a pozywka nie zawiera subst, wzrostowych…[ schemat]

* u fragaria ananassa
Aktywność wzrostu pączków bocznych uzalezniona od obecności BAP

Zalety metody : rośliny ptrzymane z pąków bocznych są jednolite pod wzgl. Genetycznym; metoda wydajna i wygodna w stosowaniu
Wady metody: młode rośliny nie SA uzyskiwane zbyt szybko, a op dalszym niż 4 odział ,należy skontrolowac rozmnażany materiał pod kątem zachodzenia w nim zmian mutacyjnych…


PRZEBIEG MIKROROZMNAŻANIA

Proces rozmnażania klonalnego obejmuje trzy fazy :

I. STABILIZACJA HODOWLI

1) Wybór rośliny matecznej i pobranie jej z organizmu
Należy przy wyborze rośliny kierować się kryterium jej wieku, stadium rozwojowego, zdrowotności; niekiedy jednak mając do dyspozycji jeden okaz , którego genotyp posada pożądane przez badacza cechy i musi on wówczas skupić swój wysiłek na tym jednym, konkretnym egzemplarzu

Wg badaczy Bigot’a i Murashige : przygotowanie rośliny matecznej przez poddawanie jej odpowiednio kontrolowanym czynnikom fizycznym, może modyfikować poziom endogennych cytokinin i auksyn, decydując w ten sposób o możliwościach i kierunku organogenezy w eksplantantach.

Wpływ stadium rozwojowego na przebieg organogenezy w eksplantantach:
- pobranie materiału w stadium wzrostu wegetatywnego , regenerowane są pąki wegetatywne
- ------------------„--------------- „--------- generatywnego , --------------„-------------kwiatowe
- zwracano tez uwagę na bezowocne izolowanie eksplantatów z roślin znajdujących się w okresie spoczynku lub przed rozpoczęciem tego okresu
-badania nad pakami drzew owocowych wykazały, że ich roczny rytm rozwojowy determinował rozwój paków w warunkach hodowli tkanek;
- zabiegi na roślinach przed dokonaniem eksplantacji miały wpływ na przebieg organogenezy,np zaciemnianie roślin na 12-14 dni powodowało drobnienie liści regenerujących eksplanatów.

2) Wybór organu przeznaczonego do rozmnażania wegetatywnego
Zaleca się izolacje eksplantatów z organów młodych, zawierających tkankę merystematyczną w postaci merystemów wierzchołkowych , bocznych lub interkalarnych oraz komórek merystemoildalnych zdolnych do przekształcenia się in vitro w centra merystematyczne . stąd najczestszy wybór badaczy pada na takie organy jak : korzeń, bulwy, cebule, kłącza, rozłogi, zwykłe pędy liści i wąsów , elementy kwiatu i kwiatostanu, nasiona ( zarodek, bielmo), siewki (liścienie, hipokotyl) w tych ostatnich dostrzezono bardzo wysoki potencjał morfogenetyczny

Korzystniej jest pobudzać do regeneracji eksplantatu o możliwie jednorodnym składzie populacji komórek , które jednakowo zareagują na na symulacje regulatorami wzrostu., tkanki jednorodne to:
- kambium waskularne
- parenchyma liścia
- liścienie
Gdy mamy do czynienia z mieszana populacją komórek w taknce inicjalnej, będzie regenerowany kompleks różnorodnych komórek kalusa , a stymulowanie ich regulatorami wzrostu jeszcze uwydatni ich zmienność pod względem cech fizjologicznych, stopnia poliploidalności, zdolności do regeneracji.

3) Dezynfekcja, traktowanie wstępne
Stabilizacja hodowli to uzyskanie aseptycznego i zdolnego do regeneracji eksplantatu. Zatem proces ten nie może prowadzic do uszkodzenia lub osłabienia eksplantatu.
Przebieg odkażania:
a)przemycie organu pod bieżąca wodą
b)zanurzenie na ok. 30 sek. W 70% alkoholu etylowym( paki drzew 5 min. 80%)
c) własciwa dezynfekcja: 3-15 min. W roztworze podchlorynu sodowego lub wapniowego z dodatkiem detergentu; mogą to być też: 0,2-1% HgCl [3-5 min.], woda chlorowa [10 min], 0,5-1 % chloramina [5-10 min]
d) przemycie 3 do 6 x w sterylnej wodxie destylowanej i lekkie osuszenie sterylnymi bibułami filtracyjnymi
gdy mamy do czynienia z systemicznym zakażeniem przez patogeny (bakterie, grzyby) ,kontynuacją dezynfekcji są hodowle wstępne [prakultury], gdzie zachodzi eliminowanie patogena poprzez wyłożenie eksplantatu na pożywke zawierającą antybiotyki ,np.:
achromycyna  bulwy
mykoatatyna paki drzew
antymetabolity  wirusy lub fungicydy
dalej organ musi zostać podzielony na eksplantatu , o takiej wielkości,by była wprost proporcjonalna do ich zdolności regeneracyjnych

4) Pożywki do rozmnażania
Najczęściej zalecana pozywką jest pozywka podstawowa Murashige i \Skoog’a , oparta na zestawie mikro- i makroelementów z dodatkiem 170 mg/dm3 NaH2PO4 x H2O, 80 mg /dm3 siarczanu adeniny, 100 mg/ dm3 inozytolu, 0,4 mg/ dm3 tiaminy, 8% agaru oraz 3% sacharozy.
 Pozywka ta sprawdza się w pobudzaniu organogenezy wielu gat. Roślin .
 Wcelu indukowania wzrostu tk.kalusowej dodaje się: 0,1mg kinetyny oraz 0,3mg/dm3 NAA lub 2,4D.
 Podczas stymulacji powstawania paków przybyszowych : 2mg/dm3 kinetyny i 2 mg/dm3 IAA
 Dla intensywnego rozwoju paków należy stosować: 30 mg/dm3 2iP i 0,3 mg/dm3 IAA
 Ukorzenianie merystemów: 1 mg/dm3 kinetyny i 0,3 mg/dm3 IAA
Niektórzy badacze uważają ,że użycie 2,4 –D w cel;u rutynowego rozmnażania nie jest wskazane ze względu na możliwość wystąpienia zmiannoości w otrzymanym tą metodą materiale

II. ROZMNAŻANIE HODOWLI

1. Uzyskany wcześniej materiał dzieli się i pasażuje aż do otrzymania wymaganej jego ilości do rozmnożenia. Szczególnie ważna jest tu rola regulatorów wzrostu, przy czymnie zawsze wymagane są zrównoważone ilości auksyn i cytokinin. Niekiedy wystarczy stymulować organogenezę tylko jednym z tych stymulatorów, ponieważ niekiedy obserwuje się znaczną zasobność eksplantatu inicjalnego w endogenne związki którejś z wymienionych klas., np. i Liliom i Hyacintus – wysoki poziom cytokinin endogennych, a formowanie się cebulek przybyszowych tylko pod wpływem auksyny. Stąd też postulat wcześniejszego badania na obecność endogennych stymulatorów wzrostu w celu uzyskania harmonijnego przebiegu organogenezy.
Wśród cytokinin najczęściej stosowane to :
- zeatyna
-2iP6-(gama-gamma-dimetyloallilo)aminopuryna
-KIN =kinetyna
-BAP= 6-benzyloaminopuryna
-PBA=(6-benzyloamino)-9-(2-tetrahydropiranylo)H-puryna
W fazie rozmnażania należy liczyć się z następującymi zjawiskami:

a)sekrecja substancji autotoksycznych, które w miarę przedłużania się czasu trwania hodowli powoduja obniżenie żywotności eksplantatów a w końcu samozatruciestosowanie przeciwutleniaczy[ditiotreitol, kw. askorbinowy]
b)ubytek materiałów energetycznych, co może doprowadzić do zachwiania zdolności regeneracyjnych
c)nadmierne tworzenie się tk. Kalusowej pod wpływem zbyt dużej ilości auksyn endogennych węgiel aktywowany [również do pochłaniania substancji lotnych i innych wydzielanych przez rozmnażane tkanki],ale III.egiel akt. Działa hamująco na pobieranie cytokinin z pożywki ,totez jego stosowanie musi odbywac się przy odpowiedniej kompensacji regulatorów wzrostu

2. Natężenie światła i jego skład spektralny
Optimum natęż. Światła wynosi 1000-3000 lux
Niższe nat. światła opóźnia wzrost eksplantatów i powoduje chlorozy. Lampy fluorescencyjne stanowią światło szczególnie wskazane, odznaczające się wysoką emisja światła w paśmie czerwieni i błękitu.
Ultrafiolet stymuluje powstawanie pąków lub tkanki kalusowej ;
Błękit sprzyja procesom ryzogenezy
Zachowanie cyklów dobowych przy 16[godzinnym periodzie sprzyja formowaniu się korzeni i pąków przez większośc gat. Roślin;
Niekiedy [ w szczególnych przypadkach]zauważono korzystny wpływ zaciemnienia hodowli na przebieg organogenezy np. Fressia, Liliom

IV. UKORZENIANIE I WYSADZANIE ROŚLIN
W tym celu przenosi się eksplantatu na świeżą pożywkę podstawową ( Murashige, Skoog) z dodatkiem 1-10 mg/dm3 IAA lub IBA albo 0,2- 0,3 mg/dm3 NAA, następnie rośliny ulegaja hartowaniu i wzmacnianiu.