rekombinowanie DNA w przemyśle

REKOMBINOWANE DNA W PRZEMYŚLE.
Bardziej prozaicznym zastosowaniem inżynierii białek może być ulepszanie enzymów stosowanych przy produkcji detergentów np. subtylizyny. Nowy jej wariant to tzw. cząsteczka drugiej generacji , która nie jest dezaktywowana przez wybielacze. Podjęte są także prace nad cząsteczką trzeciej generacji , która wykazywałaby zmniejszoną wrażliwość na temperaturę.
Ponadto nowe technologie znajdują zastosowanie w :
- syntezie biopolimerów
- produkcji opakowań.
Thaumatyna - roślinne białko tysiąc razy słodsze niż sacharoza może mieć niesamowite znaczenie jako potencjalny dodatek do produktów spożywczych , zastępując chemiczne słodziki takie jak np. sacharyna. Gen kodujący thaumatynę został sklonowany w wektorze drożdżowym pod silnym promotorem. Białko jest produkowane w bardzo dużej ilości , co w warunkach naturalnych nie jest osiągalne.
Renina - białko używane w wielkich ilościach w przemyśle serowarskim. Do genu białka została dodana sekwencja sygnałowa , która powoduje , że jest ono wydzielane bardzo intensywnie we właściwej formie przez drożdże.
Udoskonalono pewne cechy roślin korzystne przemysłowo np. stworzono odmiany wysokoskrobiowe czy odmiany o pożądanym składzie skrobii - zmiana proporcji amylazy i amylopektyny nadająca przezroczystość , zmiana procentu kwasów tłuszczowych nienasyconych.
TRANSGENICZNE ROŚLINY I ZWIERZĘTA - STRACH MA WIELKIE OCZY.
Organizm transgeniczny - organizm wyższy , do genomu którego wprowadzono nowy gen , heterologiczny (z innego organizmu) w taki sposób , aby znalazł się on zarówno w komórkach somatycznych jak i komórkach pasma płciowego dzięki czemu podlega dziedziczeniu. Jest to trwała modyfikacja genetyczna.
Technika uzyskiwania takich organizmów różni się w zależności od tego czy mamy do czynienia z rośliną czy zwierzęciem.
ROŚLINY.
Ich wielka plastyczność rozwojowa i genetyczna jest spowodowana faktem , że komórki tkanek twórczych , odpowiadające komórkom embrionalnym , występują w roślinie przez całe życie a i niektóre komórki zróżnicowane dość łatwo ulegają odróżnicowaniu - są totipotentne. Ponadto łatwo ulegają transformacji. Nie jest to jednak równoznaczne ze stabilną ekspresją. Najczęściej efekt transgenu gaśnie po paru pokoleniach ponieważ istnieją aktywne mechnizmy eliminujące efekt zakłócenia równowagi. Inną niedogodnością jest brak możliwości u roślin celowania w określone miejsce w genomie ponieważ homologiczna rekombinacja jest na bardzo niskim poziomie.
Metody transgenizacji :
- Naturalny system wprowadzania DNA - plazmidy Agrobacterium jako wektory DNA dla roślin dwuliściennych.
Plazmidy Ti z Agrobacterium tumefaciens kodują geny odpowiedzialne za syntezę pochodnych aminokwasów tzw. opin , które bakterie wykorzystują jako źródło węgla. Poza tym na plazmidzie są geny sterujące katabolizmem opin , warunkujące transfer plazmidu i jego replikację. Część tego plazmidu tzw. T-DNA długości około 23 kb po zakażeniu ulega integracji z genomem rośliny i właśnie zamiast tego odcinka możemy wstawić obce DNA. Na obu jego końcach leżą krótkie powtórzenia (24-25 bp) niezbędne do integracji z genomem. W procesie przenoszenia T-DNA do komórki roślinnej uczestniczą także geny plazmidowego regionu vir i pewne geny zlokalizowane na chromosomie bakterii.
- Możliwa jest także bezwektorowa transfekcja komórek roślinnych.
Inkubacja roślinnych protoplastów ze zlinearyzowanym plazmidem DNA zawierającym marker selekcyjny w warunkach umożliwiających pobranie DNA np. z glikolem polietylenowym w alkalicznym środowisku czy elektroporacja (krótkotrwałe , wysokonapięciowe impulsy elektryczne). Inny sposób to mikroiniekcja - bezpośrednie wstrzyknięcie DNA a także
zastosowanie "armatki genowej" - wstrzeliwanie drobnych kuleczek wolframowych opłaszczonych DNA. Używa się również liposomy (lipidowe pęcherzyki zapewniające ochronę przed nukleazami) ze zrekombinowanym DNA , które ulegają fuzji z protoplastami.
Sukcesy:
- Zwiększanie trwałości roślin dzięki ingerencji w ich metabolizm np. stworzenie niegnijącego pomidora poprzez wykorzystanie strategii antysensu tzn. transformacja antysensownym RNA . Gen antysensownego RNA ma sekwencję komplementarną do genu , którego ekspresję zamierzamy wyłączyć - w tym przypadku do genu poligalakturonazy. Oba geny ulegają transkrypcji a więc powstaje mRNA i antysensowny mRNA. Łączą się one tworząc dupleksy uniemożliwiając syntezę białka. Możliwa jest także ingerencja w system syntezy etylenu przy pomocy strategii kosupresji. Wprowadza się do genomu gen natywny dodatkowy , zamiast wzmożonej ekspresji obserwuje się efekt odwrotny aż do wygaszenia. Uzyskano w ten sposób niewiędnące goździki.


- Wykorzystanie roślin jako bioreaktorów do produkcji białek heterologicznych spowodowane jest szeregiem zalet , m.in. tanimi kosztami i dużą ilością produkowanego białka. W ten sposób produkowane są interleukiny , cytokiny , hormony wzrostu , przeciwciała.
- Uzyskanie nowych odmian - nowych kolorów , kształtów , właściwości wzrostu np. roślin ozdobnych m.in. pomarańczowe petunie (transformacja z udziałem Agrobacterium genem ze szlaku produkcji antocyjaniny z kukurydzy) czy przekształcenie ziemniaka w roślinę ozdobną.



- Uodpornienie roślin na infekcje co daje zwiększone plony , lepszy wzrost i wyższą jakość poprzez zainfekowanie ich szczepem wirusowym powodującym łagodniejszy efekt chroni przed infekcją przez bardziej zjadliwy szczep lub transgenizacja genami kodującymi białko płaszcza danego wirusa np. wirusa mozaiki tytoniowej.
- Ochrona przed owadami np. dzięki ekspresji toksyny bakteryjnej Bacillus thuringiensis chroniona jest bawełna lub dzięki transgenicznej ekspresji inhibitora proteaz serynowych - tytoń.
- Odporność roślin uprawnych na herbicydy uzyskiwana na trzy sposoby : nadprodukcja enzymu inaktywowanego przez dany herbicyd , ekspresja zmutowanego enzymu , na który związek nie działa albo ekspresja enzymu , który detoksyfikuje herbicyd.
ZWIERZĘTA.
Transgeniczne zwierzęta to organizmy , które mają obcy DNA wbudowane trwale do komórek rozrodczych - komórek linii płciowej.
Uzyskuje się je trzema sposobami :
- dzięki mikroiniekcji in vitro DNA do jednego z przedjądrzy zapłodnionej komórki jajowej przed pierwszym jej podziałem ,


- przez infekcję wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego ,
- poprzez modyfikację genetyczną pierwotnych komórek węzła zarodkowego i wprowadzenie ich do zarodka w stadium blastocysty, ponieważ komórki węzła zarodkowego są zdolne do różnicowania się we wszystkie typy komórek,

dorosła mysz poddana wcześniej takiemu zabiegowi będzie chimerą - będzie złożona z komórek węzła zarodkowego oryginalnego zarodka i z komórek transgenicznych , dalsze krzyżówki pozwalają uzyskać myszy homozygotyczne pod względem transgenu.

Pierwszym zwierzęciem transgenicznym była mysz z genem hormonu wzrostu szczura.
Pewien procent transgenów włącza się we właściwej pozycji genomowej w wyniku homologicznej rekombinacji. Pozwala to na celowe uszkodzenie badanego genu i uzyskanie tzw. myszy transgenicznych z`knock-out`owanych dzięki którym możliwe staje się badanie roli pewnych genów.


Myszy takie mogą być używane jako modele zwierzęce ludzkich chorób , co ma nieocenioną wartość w poznawaniu procesu przebiegu a także projektowaniu metod leczenia. Transgeniczne myszy nie posiadające funkcjonalnego genu rag-2 (aktywatora rekombinazy 2) nie produkują limfocytów T i B i są odpowiednikiem SCID. Udało się także stworzyć myszy defektywne w wytwarzaniu interferonu , interleukin i in.
Przeprowadzono podobne doświadczenia na królikach , świniach i owcach. Istotnym ograniczeniem była częstość z jaką powstawały transgeniczne zwierzęta ponieważ tylko 1 na 200 prób mikroiniekcji do jaja dawała takie zwierzę. To jest jakieś 10 do 15 razy rzadziej niż w przypadku myszy.
Jedną z dziedzin biotechnologii , obecnie bardzo intensywnie rozwijaną jest klonowanie zarodków ssaków. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie wielu identycznych osobników. Wzbudza to ogromne zainteresowanie m.in. hodowców mających nadzieje na stworzenie jak największej liczby zwierząt o pożądanych cechach.
Przeprowadza się to wieloma metodami :
1. Metodą izolacji blastomerów.
W miarę kolejnych podziałów zygoty powstaje wiele komórek potomnych - blastomerów. Początkowo każdy z nich jest taki sam i teoretycznie posiada możliwość utworzenia wszystkich pozostałych komórek. Znaczy to , że w tym stadium z każdego blastomeru może powstać cały organizm. Doświadczalnie zostało to potwierdzone dla stadium nie przekraczającego ośmiu blastomerów. Jest to także uzależnione od gatunku.
2. Metodą agregacji blastomerów.
Jest to w pewnym sensie odmiana metody poprzedniej. Otaczając pojedynczy blastomer innymi zwiększa się szansę wytworzenia węzła zarodkowego w ogóle (niezbędna jest obecność pewnej masy komórkowej) a zarazem utworzenia go z centralnie ulokowanego blastomeru. Nie znalazła praktycznego zastosowania.
3. Metodą bisekcji zarodków.
Najszerzej stosowana. Polega na mikrochirurgicznym dzieleniu zarodków (wczesnych zarodków , morul , blastocyst) na połowę.
4. Metodą transplantacji jąder komórek zarodkowych.
Jest to jedyna metoda pozwalająca na uzyskanie klonów liczących większą liczbę osobników. Usuwane są oba przedjądrza zygoty lub chromosomy z nie zapłodnionych oocytów a następnie wprowadzane są na ich miejsce jądra z blastomerów zarodków. Wprowadzenie uzyskuje się różnymi metodami : mikrochirurgiczną transplantacją , metodą fuzji komórkowych czego odmianą jest elektrofuzja itd.
Wszystkimi wyżej wymienionymi metodami podejmowano próby klonowania przedstawicieli takich gatunków jak myszy , króliki , owce i in. Należy jednak podkreślić , że były to manipulacje komórkami niezróżnicowanymi - komórkami embrionalnymi a więc zachowującymi pewną naturalną totipotentność.
Zupełnie odrębną metodą są próby klonowania z wykorzystaniem dorosłych , zróżnicowanych komórek ssaczych. Najsławniejsza owca świata - Dolly powstała w ten właśnie sposób. Po raz pierwszy udało się sklonować organizm korzystając z komórki dorosłego ssaka. Materiał genetyczny dorosłej , somatycznej komórki jednej owcy wprowadzono do cytoplazmy komórki jajowej pozbawionej jądra drugiej owcy i implantowano do macicy trzeciej. W tym przypadku należy jednak zachować nieco sceptycyzmu. Przede wszystkim dlatego , że eksperymentu tego nie udało się jeszcze nikomu powtórzyć. Ponadto próba ta udała się tylko raz na niemal trzysta. Ponieważ wiadomo skądinąd , że z podobną częstością występują w tkance , z której pobrano komórki , komórki niezróżnicowane a także , że owca , od której je pobrano była w ciąży , sklonowane zwierzę może być pomyłką lub przypadkiem. Technika jaką zastosowano wiąże się ponadto ze sporym ryzykiem deformacji rozwojowych a także jej istotną wadą jest bardzo niska wydajność. Daleka więc jeszcze droga do sukcesu w tej dziedzinie. Jednak wyścig już się zaczął.