Podstawy inżynerii genetycznej i jej zastosowania

INŻYNERIA GENETYCZNA to działania polegające na wprowadzeniu do komórek organizmu biorcy ściśle określonego odcinka DNA dawcy, odpowiadającego jednemu lub kilku genom, w celu trwałej zmiany właściwości biorcy.

BIOTECHNOLOGIA obejmuje m.in. wszelkie manipulacje żywymi organizmami w celu osiągnięcia określonych korzyści.

Odcinki DNA dawcy, które mają być wprowadzone do komórek odpowiedniego gospodarza (komórki bakteryjne lub eukariotyczne), otrzymuje się przez ich wycięcie za pomocą specyficznych enzymów restrykcyjnych (?molekularne nożyce) lub syntetyzuje się chemicznie.
Większość enzymów restrykcyjnych rozpoznaje ściśle określone sekwencje nukleotydów w cząsteczce DNA i przecina ją w obrębie tych sekwencji. Rozpoznawane sekwencje są zazwyczaj cztero- lub sześcionukleotydowe i mają charakter palindromów tzn. że kolejność nukleotydów jednej nici DNA jest identyczne jak drugiej nici (komplementarnej), jeśli jest ona ?czytana? w przeciwnym kierunku. Te sekwencje nukleotydowe są symetryczne względem punktu środkowego.
Główna rolą enzymów restrykcyjnych w komórkach bakteryjnych jest ochrona przed inwazją obcego kwasu nukleinowego, głównie fagowego. Jeżeli DNA infekującego faga wniknie do komórki bakterii, enzymy restrykcyjne rozpoznają go i przecinają. Powstają mniejsze fragmenty, które ulegają rozłożeniu do nukleotydów przez specyficzne enzymy obecne w cytoplazmie. Aby enzym restrykcyjny nie atakował własnego DNA bakteryjnego istnieje system ochraniający własny DNA. System ten polega na modyfikacji zasad sekwencji nukleotydów rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne. Taka modyfikacja nie jest rozpoznawana przez enzym restrykcyjny.
Niektóre enzymy restrykcyjne przecinają obie nici rozpoznawanej sekwencji DNA w miejscach leżących dokładnie naprzeciwko siebie. Powstają wtedy tzw. Tępe końce. Jednak większość enzymów restrykcyjnych przecina obie nici rozpoznawanej sekwencji w cząsteczce DNA w miejscach przesuniętych względem siebie. Przecięcia w każdej nici są oddzielone kilkoma parami zasad azotowych. Powstają fragmenty o jednoniciowych końcach komplementarne względem siebie, tzw. Lepkie końce.
Produktem przecięcia długich cząsteczek DNA są liczne fragmenty o różnej długości. Powszechnie stosowaną techniką rozdziału jest elektroforeza, polegająca na wędrówce cząsteczki DNA w stałym polu elektrycznym. Prowadza się ją na specjalnie przygotowanej cienkiej, galaretowatej płytce, tzw. żelu.
Próbkę roztworu zawierających mieszaninę fragmentów DNA nanosi się do niewielkiego zagłębienia w żelu. Następnie przez płytkę zostaje przepuszczony prąd elektryczny. Fragmenty Dna maja ujemny ładunek elektryczny, a więc przemieszczają się od punktu naniesienia, zlokalizowanego w pobliżu ujemnej elektrody ? anody, w kierunku dodatniej elektrody ? katody. Żel jest gęsty dlatego krótsze fragmenty poruszają się szybciej. Fragmenty ulegają rozdzieleniu, aby określić ich lokalizację barwi się je odpowiednio. W żelu są widoczne jako prążki. Prążki będące najdłuższymi fragmentami DNA są najbliżej miejsca naniesienia, a krótsze są oddalone. Każdy enzym restrykcyjny przecina DNA w innym miejscu, to ta sama cząsteczka DNA, w zależności od zastosowania enzymu, daje różne układy prążków.
Wytwarzanie lepkich końców umożliwia łącznie odcinków DNA pochodzących z różnych źródeł. Jeżeli 2 cząsteczki DNA pochodzące z różnych organizmów zostaną przecięte tym samym enzymem restrykcyjnym, to powstaną fragmenty o pasujących do siebie lepkich końcach. Wymieszanie tych fragmentów umożliwi dopasowanie komplementarnych lepkich końców. Takie nici można połączyć wiązaniami chemicznymi, działając enzymem ligazą. Powstaje stabilna zrekombinowana cząsteczka DNA, będąca efektem łączenia cząsteczek DNA pochodzących z różnych organizmów.
Rekombinacja genetyczna, której źródłem jest m.in. proces crossing-over, polegający na wymianie odcinków między chromatydami chromosomów homologicznych (zachodzący podczas podziału mejotycznego). W procesie tym bierze udział wiele enzymów przecinających i łączących ponownie odcinki DNA. Powstają nowe kombinacje cech organizmów. Rekombinacja genetyczna jest jednym z głównych źródeł zmienności. Natomiast w rekombinacji in vitro są stosowane enzymy restrykcyjne, które nie biorą udziału w procesie rekombinacji genetycznej.
Inżynieria genetyczna posługuje się rekombinacją cząsteczki DNA in vitro (w układach pozakomórkowych), łącząc ze sobą cząsteczki DNA pochodzące z różnych organizmów. Nowo powstałą kombinację materiału genetycznego można powielić i uzyskać ekspresję wprowadzonych genów, dzięki połączeniu obcych fragmentów DNA z niewielkimi cząsteczkami DNA odgrywającymi rolę nośnika ? wektora, za pomocą którego obce DNA zostaje wprowadzone do komórek odpowiedniego gospodarza. Wektory mają zdolność autonomicznej replikacji. Dzięki połączeniu z wektorem obcy fragment DNA może ulegać replikacji w komórkach gospodarza należącego do innego gatunku. Proces replikacji (powielania) wyizolowanego genu jest nazywany w inżynierii genetycznej klonowaniem genu. Zwykle gospodarzem są komórki bakteryjne np. pałeczki okrężnicy, ale oprócz nich do klonowania DNA wykorzystuje się komórki eukariotyczne. Jako wektory stosuje się specjalne cząsteczki bakteryjnego DNA, tzw. plazmidy, które zwykle są kolistymi cząsteczkami dwuniciowego DNA, występującymi u wielu gatunków bakterii.
O użyteczności wektora decyduje możliwość wprowadzenia do niego obcego DNA, czyli obecność co najmniej jednej sekwencji rozpoznawanej i ciętej przez określony enzym restrykcyjny. Przecięcie plazmidu w danym miejscu oraz DNA innego organizmu tym samym enzymem restrykcyjnym daje szansę otrzymania zrekombinowanej cząsteczki wektora. Zrekombinowany plazmid trzeba wprowadzić do komórki bakterii (gospodarza) i umieścić na szalce Petriego. Otrzymuje się kolonie bakterii, które są klonem , powstała przez podziały jednej komórki wyjściowej.
W procesie przenoszenia obcych genów do komórek gospodarza ważnym elementem jest wprowadzenie wektorów do komórek z zastosowaniem różnych metod.
Bakterie mogą uzyskiwać nową informację genetyczną na kilka sposobów:
- Dzięki wniknięciu do komórki cząsteczek DNA obcych w pożywce hodowlanej;
- Przez bezpośrednie przeniesienie z innej komórki bakteryjnej;
- Za pomocą infekcji cząsteczki faga;
W przypadku komórek eukariotycznych stosuje się trudne metody. Jedna z nich polega na czasowym zwiększeniu przepuszczalności błony komórkowej przez poddanie komórek krótkim impulsom pola elektrycznego. Najtrudniej jest z komórkami roślin, bo mają sztywną ścianę komórkową.
Inżynieria genetyczna stosowana jest w badaniach naukowych, w medycynie, w terapii genowej. Np. insulina ludzki, hormon wzrostu. Hodowla zwierząt i uprawa roślin.