Rekombinacja DNA w medycynie i farmacji

REKOMBINOWANE DNA W MEDYCYNIE I FARMACJI
Pierwszym udanym eksperymentem tego typu było wyprodukowanie ludzkiego białka - somatostatyny - 14 aminokwasowego neurotransmitera peptydowego. Gen kodujący somatostatynę został zsyntetyzowany chemicznie i sklonowany w wektorze plazmidowym eksprymowanym w E.coli. Pierwszym komercyjnym produktem była ludzka insulina.
Obecnie dzięki technologii rekombinowanego DNA uzyskiwane są białka wykorzystywane w leczeniu szeregu chorób : raka , alergii , chorób autoimmunologicznych , neurologicznych , atakach serca , chorobach krwi , infekcjach , chorobach genetycznych.
Całkiem nowe podejście do produkcji leków wyrosło właśnie z technologii rekombinacji DNA , gdy uczeni uzyskali możliwość tworzenia subtelnych zmian w naturalnych białkach usprawniających ich funkcjonowanie i zwiększających użyteczność.
Techniki i metody stosowane w inżynierii genetycznej wykorzystuje się przy produkcji :
- szeregu enzymów
- biologicznie czynnych białek (interferony , czynniki krzepnięcia)
- antybiotyków (penicylina , streptomycyna)
- hormonów (insulina , somatotropina , somatostatyna).
Ponadto znalazły one zastosowanie przy :
- mapowaniu chromosomów
- wykrywaniu mutacji punktowych np. beta-talasemii , fenyloketonurii , dystrofii mięśniowej
Duchenne`a)
- wykrywaniu submikroskopowych delecji , insercji czy translokacji
- badaniu RFLP m.in. w przypadku koagulopatii , mukowiscydozy itd.
RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Indywidualne genomy ludzkie różnią się między sobą - występuje polimorfizm genetyczny. Odcinki DNA uzyskane po trawieniu restrykatazami są charakterystyczne dla każdego genomu. Udało się w przypadku niektórych chorób o podłożu genetycznym skorelować mutację powodującą stratę bądź uzyskanie miejsca restrykcyjnego z występowaniem choroby.




INŻYNIERIA GENETYCZNA W MEDYCYNIE I FARMACJI
PROFILAKTYKA
 Choroby infekcyjne - nowa generacja szczepionek :
1. Szczepionki zawierające żywe atenuowane drobnoustroje (atenuacja przez wprowadzenie do genomu ściśle określonych mutacji delecyjnych).
Przykłady :
- szczepionki przeciwko Salmonella typhi.
2. Szczepionki podjednostkowe :
- białka rekombinacyjne - wektory pochodzenia wirusowego zrekombinowane z genami kodującymi immunogenne białka organizmu patogennego
- białka syntetyczne.
Przykłady :
- nowa szczepionka antykrztuścowa
- fragment genu Clostridium tetani kodujący domenę toksyny odpowiedzialną za jej immunogenność sklonowano w komórkach E.coli
- szczepionka przeciwko wirusowi żółtaczki Hepatitis B produkowana w komórkach drożdży dzięki ekspresji antygenu otoczki wirusowej : gen białka otoczki został wstawiony w wysokokopijny wektor drożdżowy , wirusowe białko było produkowane w dużej ilości.
3. Profilaktyka genowa tzw. III generacja szczepionek :
- podanie czystego genu - "nagie" szczepionki.
Przykłady :
- wstrzyknięcie do mięśni szkieletowych DNA wirusa grypy w formie plazmidu indukuje powstanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T.
Szczepionki otrzymane metodami rekombinacji DNA są stabilne a ich stosowaniu nie towarzyszą niepożądane objawy , proces wytwarzania jest bezpieczny. Preparaty można stosunkowo szybko modyfikować i dostosowywać do zmian cech patogennego organizmu.
 Choroby genetyczne spowodowane defektem w pojedynczym genie bądź wielogenowe.
Strategia większości szczepionek nowotworowych polega na dostarczeniu antygenów nowotworowych wraz z odpowiednim sygnałem kostymulującym co ma na celu swoistą aktywację układu odpornościowego przeciwko komórkom przerzutowym nowotworu. Powstała koncepcja nowej generacji szczepionek nowotworowych genetycznie modyfikowanych. Strategia polega na pobraniu i izolacji komórek nowotworowych od chorego , wprowadzeniu genu czynnika immunomodulującego (cytokiny , antygeny nowotworowe itp.) , namnożeniu in vitro i podaniu podskórnym choremu lub bezpośrednio do guza. Jako nośnika genów używane są rekombinowane wirusy , głównie retrowirusy i adenowirusy. Podejmowane są próby w profilaktyce głównie czerniaka złośliwego , raka nerki , białaczki , raka płuc i piersi.
DIAGNOSTYKA
 Choroby infekcyjne :
- sondy genetyczne - diagnozowanie bez konieczności namnażania mikroorganizmów
- PCR - wykrywanie minimalnej ilości mikroorganizmów.
 Choroby genetyczne :
Lista chorób , które można obecnie rozpoznawać wykorzystując techniki analizy DNA obejmuje już w tej chwili dobrze ponad sto jednostek chorobowych , m.in. są to : achondroplazja, hemofilia , fenyloketonuria , anemia sierpowata , talasemie , mukowiscydoza i in.
- diagnostyka prenatalna m.in. RFLP
- choroby nowotworowe.
TERAPIA
 Nowa generacja leków.
Przykłady :
1. Insulina - pierwszy lek uzyskany technikami inżynierii genetycznej , który uzyskał licencję.
Insulina używana wcześniej w leczeniu cukrzycy , uzyskiwana z trzustek świni i krów , nie była identyczna z ludzką. Dlatego też niektórzy pacjenci wytwarzali przeciwciała przeciwko temu białku. Insulina stworzona dzięki inżynierii genetycznej jest identyczna z ludzką. Eksprymowana jest w komórkach E.coli. Poprzednio łańcuchy A i B były produkowane oddzielnie a następnie fałdowane w dojrzałą cząsteczkę insuliny. Obecnie w celu produkcji komercyjnej , eksprymowane jest pojedyncze fuzyjne białko , które następnie jest przecinane i w taki sposób uzyskuje się w jednym kroku dojrzałą , zrekombinowaną insulinę.
2. Ludzki hormon wzrostu (hGH) - produkowany w komórkach bakteryjnych na dwa sposoby. Skonstruowano wektor ekspresyjny używając cDNA kodującego większość aminokwasów i dodano syntetyczny oligonukleotyd początkowy. Hormon był eksprymowany wewnątrzkomórkowo. Drugim sposobem było dodanie na początku genu sekwencji sygnałowej , która umożliwiła transport białka do przestrzeni peryplazmatycznej skąd łatwo można było uwolić hormon za pomocą dysrupcji hypotonicznej zewnętrznej błony.
3. Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest produkowany komercyjnie w ssaczych kulturach komórkowych. Sklonowano ludzkie cDNA tego genu , wstawiono pod silny promotor i terminator. Wektorem została stabilnie stransfekowana linia komórek ssaczych. Linie wysoko eksprymujące to białko hodowane są w dużych fermentatorach a zrekombinowany tPA jest oczyszczany z pożywki.
4. Czynnik VIII , niezbędny do prawidłowego krzepnięcia krwi , jest także produkowany przez ssacze komórki. Od wielu lat hemofilitykom podawano ten czynnik oczyszczany z ludzkiej krwi. Przyczyniło się to w pewien sposób do rozszerzenia pandemii AIDS. Obecnie cDNA genu tego białka zostało sklonowane. Podobnie jak tPA , czynnik VIII jest dużym kompleksem białkowym , który prawidłowo może być składany i produkowany tylko w komórkach ssaczych.

 Somatyczna terapia genowa - genetyczne modyfikacje komórek somatycznych.
Terapia genowa poprzedzona musi być sklonowaniem odpowiedniego genu , identyfikacją jego sekwencji regulacyjnych i komórek , w których działa oraz wyborem wydajnych metod ich transfekcji. Powinno się także przeprowadzić badania , które bezsprzecznie dowiodą , że wprowadzony prawidłowy gen działa zgodnie z przewidywaniami a także nie narusza metabolizmu zrówno komórki , do której go wprowadzono jak i całego organizmu. Możliwe są dwa warianty terapii : albo wprowadza się kilka dodatkowych kopii prawidłowego genu albo wymienia gen defektywny na prawidłowy. Metody wprowadzenia genu także są dwie : albo pobiera się docelowe komórki z organizmu pacjenta , modyfikuje genetycznie in vitro , po czym powtórnie wprowadza do organizmu albo wprowadza się gen bezpośrednio do całego organizmu lub tkanki.
Trudności :
- kłopoty ze znalezieniem wydajnego systemu transfekcji komórek eukariotycznych
- charakter ekspresji wprowadzonych genów niestety najczęściej jest przejściowy.
Podejmuje się próby leczenia :
- chorób spowodowanych defektem w pojedynczym genie
- chorób wielogenowych (układu krążenia , nerwowego , nowotwory)
- autoagresywnych chorób układu odpornościowego.
Przykłady :
- Próba wyznakowania genetycznego limfocytów odseparowanych z litego guza chorego. Wprowadzono do limfocytów marker (gen oporności na neomycynę) co pozwoliło na śledzenie ich losów po powtórnym wstrzyknięciu , następnie po ponownym pobraniu transfekowano je in vitro genami kodującymi czynnik martwicy nowotworów i interleukinę 2.
- Próba leczenia SCID (ciężki złożony niedobór immunologiczny). Do krwioobiegu wprowadzono limfocyty transfekowane wektorem retrowirusowym z prawidłowym genem. Rezultatem była odporność na antygeny i pojawienie się przeciwciał.
- Próba leczenia hemofilii B. Wprowadzono gen czynnika IX do hemocytoblastów za pośrednictwem wektorów retrowirusowych.
- Próba leczenia rodzinnej hipercholesterolemii. Przy udziale wektora adenowirusowego wprowadzono gen kontrolujący syntezę receptora LDL do hepatocytów.
- Próbowano także wyleczyć niedobór somatotropiny przy udziale wektora retrowirusowego przenosząc geny do hepatocytów.
Terapia genowa nie została do tej pory wprowadzona do praktyki klinicznej.
Bardzo istotnymi dla rozwoju wielu z powyższych zastosowań okazały się m.in. technologie :
 Produkcja przeciwciał monoklonalnych. Izoluje się komórki śledziony myszy immunizowanej antygenem , miesza się je ze zmutowanymi (niezdolnymi do wzrostu na pewnej pożywce) komórkami lini szpiczaka (myeloma). Niektóre z nich ulegną fuzji. Selekcjonuje się je in vitro na podłożu , na którym rosną tylko klony hybrydowe i hoduje w studzienkach zawierających potomstwo jednej komórki. Taki klon hybrydowy będzie produkował przeciwciała o pożądanej specyficzności wobec różnych determinant antygenu użytego do immunizacji i będzie nieśmiertelny. Monoklonalne przeciwciała są w tej chwili szeroko używane w diagnostyce infekcji i raka oraz do szeregu innych celów.

 W technologii zwanej inżynierią białek używa się rekombinowanego DNA w celu zmodyfikowania struktury naturalnego białka aby ulepszyć lub zmienić jego funkcje. Dobrym przykładem są tutaj przeciwciała ponieważ ich potencjalne zastosowanie w medycynie jest bardzo duże a ich struktura jest w dość znacznym stopniu poznana. Możliwe są zmiany ich domen efektorowych - regionów łańcucha ciężkiego , które wyznaczają specyficzność funkcjonowania przeciwciała. Obiecującą strategią jest zastąpienie domeny efektorowej sekwencją kodującą toksynę. Takie fuzyjne przeciwciało dostarczy toksynę specyficznie do komórek , które posiadają docelowy antygen. Może mieć to duże znaczenie w leczeniu raka lub takich wirusowych chorób jak np. AIDS.
Różnorodność nowych technologii skłania do zastanowienia się nad praktycznie nieograniczonymi możliwościami ich ingerencji , w pozytywnym tego słowa znaczeniu , w życie współczesnego człowieka.