Inżynieria genetyczna.

Celem doświadczalnych modyfikacji genomów roślinnych, podobnie jak zwierzęcych, jest zrozumienie fundamentalnych procesów biologicznych. W przypadku roślin kwestie o podstawowym znaczeniu to proces różnicowania tkanek oraz mechanizm indukowania ekspresji poszczególnych genów przez światło. Inni badacze dążą do ulepszenia roślin ważnych dla rolnictwa. Nowe i zmienione geny wprowadza się za pomocą specjalnych wektorów do pojedynczych komórek roślinnych hodowanych w laboratorium. Z poszczególnych komórek można uzyskać całą roślinę, nawet jeśli nie są to komórki zarodkowe, co w przypadku zwierząt jest niemożliwe.

W wielu eksperymentach prowadzonych na roślinach wykorzystuje się specjalne wektory pochodzące z plazmidów bakteryjnych. W naturze występują one w komórkach bakterii powodującej raka szyjki korzeniowej bardzo wielu roślin – Agrobacterium tumefaciens. Plazmidy wraz z komórkami bakteryjnymi stanowią naturalny mechanizm wprowadzania genów do roślin. Komórki A. tumefaciens wnikają do zranionych części roślin. Plazmid przedostaje się z bakterii do komórek roślinnych i część plazmidowego DNA zostaje wbudowana do genomu gospodarza. Niektóre geny plazmidowego DNA ulegają ekspresji w komórkach roślinnych. W efekcie rozwija się guz. Co dziwne, z takich rakowatych komórek można otrzymać całe, zdrowe rośliny. Jest to jedyny znany przykład naturalnego przekazywania genów komórkom eukariotycznym przez plazmidy bakteryjne. System ten wykorzystano w inżynierii genetycznej roślin – obce geny, wstawione do plazmidu A. tumefaciens za pomocą technik rekombinacji DNA, wprowadza się następnie do roślin.

Z tak transformowanych komórek otrzymano rośliny zdolne do wytwarzania zdrowych nasion, przenoszących funkcjonalne obce geny. Geny wzmacniające odporność roślin na choroby wirusowe lub herbicydy oraz kodujące związki owadobójcze zostały już wprowadzone do roślin ważnych dla rolnictwa. Wiele z nich przechodzi obecnie próby polowe. Inne badania koncentrują się na poprawieniu wartości odżywczej roślin uprawnych.

Inżynieria genetyczna zwierząt.
Chemicy pracujący nad białkami zmieniają sekwencje nukleotydowe sklonowanych genów, aby uzyskać zmienione białka w czystej postaci w dużych ilościach. Biologów zaś interesują skutki, jakie wywierają zmiany w strukturze białka, regionie regulatorowym lub w organizacji genomu na właściwości całych komórek i organizmów. W ten sposób można lepiej zrozumieć fizjologię stanów normalnych i chorobowych. Wprowadzanie zmienionych genów do komórek lub całych organizmów może pomóc w osiągnięciu tego celu. Najważniejszym dokonaniem technik rekombinacji DNA jest właśnie możliwość wprowadzania takich ściśle określonych modyfikacji. Biologia zmienia swe oblicze, z tradycyjnej nauki zajmującej się opisem budowy i działania żywych organizmów staje się dyscypliną manipulującą ich dziedzicznymi cechami. Termin „inżynieria genetyczna” jest trafnie dobrany. Co więcej, właśnie teraz, bardziej niż kiedykolwiek wcześniej, sprawdza się właściwy genetyce molekularnej redukcjonizm – kiedy badaniom poddaje się całe komórki i organizmy oraz analizuje wpływ pojedynczych genów na procesy fizjologiczne, anatomię oraz rozwój.
Jedną z podstawowych technik genetyki molekularnej jest transformacja komórek bakteryjnych i eukariotycznych za pomocą zrekombinowanych wektorów niosących geny, cDNA lub ich zmienione wersje. W przypadku bakterii czy drożdży manipulacje dokonywane na poszczególnych komórkach dotyczą oczywiście całych, jednokomórkowych organizmów. Eksperymentalną „naprawę” mutacji w komórce drożdży czy bakterii można określić mianem terapii genowej. Wcześniej opisaliśmy terapeutyczny efekt wprowadzenia ludzkiego genu ras do „chorych” komórek drożdży – „chorych” z powodu braku własnego genu ras. Jednak przeniesienie terapii genowej na grunt wielokomórkowych organizmów rozmnażających się płciowo wymaga zupełnie innego podejścia doświadczalnego i całkiem nowych koncepcji.

Jedno z rozwiązań polega na modyfikacji genetycznej tylko jednego typu zróżnicowanych komórek – komórek somatycznych. Obecnie taki eksperyment składa się z następujących etapów: 1 – pobrania odpowiednich komórek z organizmu; 2 – umieszczenia ich na szalce z pożywką umożliwiającą wzrost i podziały; 3 – transformacji wektorem zawierającym gen lub odpowiedni cDNA; 4 – wprowadzenia komórek z powrotem do organizmu. Rozważa się wykorzystanie tego sposobu postępowania w terapii niektórych ludzkich chorób genetycznych. W eksperymentach stosuje się pochodzące od ssaków komórki szpiku kostnego, wśród których znajdują się prekursory komórek krwi. Istnieje wiele metod transformacji, zazwyczaj przeprowadza się ją stosując wektory pochodzące z genomów retrowirusów przenoszących określony gen. Szczególnie interesujące próby obejmują dzieci z wadą genetyczną powodującą poważne niedobory immunologiczne. Osoby chore są homozygotami względem zmutowanego genu kodującego enzym deaminazę adenozynową. Terapia polega na wprowadzeniu prawidłowego allelu genu do limfocytów dzieci. Wiele innych chorób można próbować leczyć wprowadzając funkcjonalny gen do krwinek. Jednak nie wiadomo jeszcze, czy rezultaty obecnie prowadzonych badań będą na tyle obiecujące, by możliwe było rozpoczęcie prób klinicznych.
Zmiana komórek somatycznych nie wprowadza nowej dziedzicznej cechy do organizmu wielokomórkowego, ponieważ komórki rozrodcze powstają na stosunkowo wczesnym etapie rozwoju. Żeby wprowadzić dziedziczącą się cechę, trzeba zmodyfikować komórki linii płciowej. Do tej pory udało się przeprowadzić takie eksperymenty jedynie na nielicznych organizmach: muszce owocowej, ssakach doświadczalnych i roślinach.
W przypadku muszki owocowej komórki płciowe można zmieniać za pomocą transpozonu, tak zwanego elementu P. Zrekombinowany wektor przenoszący element P, który zawiera badany gen, wstrzykuje się do zarodka w bardzo wczesnej fazie rozwoju. Element P z wbudowanym genem przedostaje się z wektora do genomowego DNA. Dorosłe muszki rozwijające się z transformowanych zarodków zwykle zawierają element P w genomach komórek rozrodczych. Dzięki temu ich potomstwo dziedziczy nowy funkcjonalny gen.

Muszki i inne organizmy niosące eksperymentalnie wprowadzone geny, które mogą być przekazywane następnym pokoleniom, zwane są organizmami transgenicznymi, wprowadzony gen określa się mianem transgenu. Metoda ta stwarza ogromne możliwości badania procesów rozwoju i różnicowania, na przykład analizowania słabo poznanego wpływu sąsiadujących sekwencji DNA na ekspresję genu. Zauważmy bowiem, że położenie nowego genu – transgenu – w genomie transgenicznej muszki jest inne niż normalne położenie jego genomowego odpowiednika. Co więcej, u różnych, niezależnie otrzymanych transgenicznych muszek proces transpozycji umieści transgen w różnych miejscach genomu – na przykład na różnych chromosomach. Można wtedy poszukiwać odpowiedzi na takie pytania: które elementy regulatorowe muszą towarzyszyć transgenowi, żeby mógł on pełnić rolę swego oryginalnego odpowiednika zajmującego właściwe miejsce na właściwym chromosomie? Czyli – jakie elementy regulatorowe są konieczne do prawidłowej ekspresji genu na odpowiednim etapie rozwoju i w odpowiednich komórkach? Czy położenie transgenu na chromosomie ma znaczenie dla jego właściwej regulacji w poszczególnych typach komórek na różnych etapach rozwoju?
Te same pytania skłaniają naukowców do wprowadzania fragmentów obcego DNA do komórek linii płciowej ssaków doświadczalnych. Transgeniczne myszy stały się najpopularniejszym układem doświadczalnym do analizowania podstawowych problemów biologii. Badaniom poddaje się również transgeniczne ryby, owce, króliki i świnie, z nadzieją na opracowanie lepszych odmian hodowlanych oraz takich linii zwierząt, które mogłyby być wykorzystywane do produkcji ważnych w lecznictwie białek.

Transgeniczne myszy można otrzymać kilkoma metodami, jedna z nich jest jednak najbardziej skuteczna. Sklonowany gen wstrzykuje się do jądra zapłodnionej komórki jajowej. Następnym etapem jest jej implantacja w macicy myszy. Odcinek obcego DNA zostaje wbudowany do genomu na tyle wcześnie, że będzie obecny zarówno w komórkach linii płciowej, jak i w komórkach somatycznych. Następne pokolenie odziedziczy go razem ze wszystkimi innymi genami. Transgeniczne dzieci oraz ich potomstwo poddaje się szczegółowej analizie pod kątem czasu i miejsca ekspresji transgenu i ewentualnych zaburzeń powodowanych przez nowy DNA. Zazwyczaj transgen zawiera podstawowe elementy regulatorowe. Często wygodnie jest elementy regulatorowe badanego genu połączyć zamiast z nim, z innym genem – takim, którego produkt jest łatwo wykrywalny. Jest to prosty sposób umożliwiający badanie mechanizmów kontrolnych organizmu. W innych przypadkach bardziej interesujący niż funkcjonowanie sekwencji regulatorowej jest wpływ określonego białka na transgeniczne organizmy. Wówczas badaną sekwencję kodującą łączy się zazwyczaj z taką regulatorową sekwencją DNA, która zapewni jej ekspresję (zamiast z sekwencją regulatorową normalnie towarzyszącą tej sekwencji kodującej). Dzięki metodom klonowania molekularnego konstruowanie takich „mieszanych” genów nie przedstawia specjalnych trudności.

Badania nad transgenicznymi myszami pozwolą na rozwiązanie wielu kwestii; niektóre z nich można zilustrować na przykładzie genu insulinowego. Jak już wspomnieliśmy, ekspresja tego genu jest ograniczona przez segment DNA położony tuż przed genem i zachodzi tylko w wybranych komórkach trzustki. Wprowadzenie do wczesnego zarodka mysiego sztucznie skonstruowanej cząsteczki DNA złożonej z sekwencji kodującej onkogen wirusa SV40 – duży antygen T oraz z sekwencji regulatorowej genu insulinowego powoduje, że genomy wszystkich jego przyszłych potomków będą miały tę zrekombinowaną cząsteczkę. Ponieważ sekwencja kodująca duży antygen T jest w tym przypadku kontrolowana przez promotor genu insuliny, białko to będzie syntetyzowane wyłącznie w komórkach syntetyzujących insulinę. Jego rakotwórczych właściwości dowodzi powstawanie nowotworów (zwanych wyspiakami lub gruczolakami wyspowokomórkowymi) z tych, i tylko tych komórek. Doświadczenie to potwierdza wyniki uzyskane podczas badań nad hodowlami komórkowymi; sekwencje regulatorowe genu insuliny umożliwiają ekspresję genu tylko w komórkach określonego typu.

Jeśli zamiast odcinka promotorowego genu insuliny zastosuje się odcinek regulatorowy genu kodującego enzym elastazę, wynik będzie zupełnie inny. Elastaza jest wytwarzana między innymi w komórkach trzustki, innych niż syntetyzujące insulinę. I znowu, u transgenicznych myszy dochodzi do rozwoju nowotworu. W tym przypadku jednak nowotwór rozwinie się z komórek wytwarzających elastazę, a nie z komórek syntetyzujących insulinę. Pomimo użycia tego samego onkogenu – dużego antygenu T, nowotwór powstaje więc w różnych komórkach, w zależności od zastosowanych sekwencji regulatorowych.

Tego typu eksperymenty stworzyły system modelowy do badania rozwoju nowotworów oraz doskonalenia skutecznych środków terapeutycznych. Na przykład wprowadzenie innego onkogenu: myc, pod kontrolą sekwencji regulatorowych pochodzących z genomu wirusa, który powoduje u myszy raka sutka, doprowadziło do rozwoju nowotworu sutka. Prawdopodobnie więc związek między wirusem a rakiem sutka polega na tym, że komórki gruczołów mlecznych są miejscem wybiórczej ekspresji jego genów. Doświadczenie to jest również potwierdzeniem tezy, że gen myc jest onkogenem. Transgeniczne myszy można także wykorzystywać w badaniach nad wpływem różnych leków na hamowanie rozwoju nowotworów.

Wywoływanie mutacji
Inna metoda doświadczalna, mająca na celu poznanie funkcji genów w rozwoju ssaków, wykorzystuje możliwość wstawiania transgenów do genów ważnych dla prawidłowego rozwoju. Wcześniej wspominaliśmy, że transgeny stosowano w badaniach nad sygnałami regulatorowymi kontrolującymi czas i miejsce ekspresji genu oraz do modyfikacji organizmów ssaków zgodnie z zamierzeniami eksperymentatorów. Ponieważ transgeny włączają się do genomu komórki biorcy w różnych, trudnych do przewidzenia miejscach, wykorzystywano je również do badań nad wpływem lokalizacji chromosomalnej na ekspresję genu, w tym przypadku transgenu. Ponadto losowe umiejscawianie się transgenów w genomie myszy umożliwia badanie funkcji miejsc „docelowych” – tych sekwencji DNA, w które został wstawiony transgen. Takie podejście jest szczególnie użyteczne w identyfikacji genów ważnych dla procesów rozwojowych.

Czasami miejsce w genomie, w które włączył się transgen, jest regionem kodującym lub regulatorowym jakiegoś istotnego genu. Gen ten wtedy podlega mutacji. Jego funkcjonowanie może zostać wstrzymane lub zmienione, czasami też wytwarzane jest zmienione białko. Powstanie mutacji w takim genie może być całkowicie niezależne od tego, czy transgen ulega ekspresji, czy nie.

Przerwanie genu przez insercję było przez wiele lat standardowym narzędziem pracy genetyków badających bakterie, drożdże, muszkę owocową czy kukurydzę. Wówczas do „przerywania” genu używano elementów ruchomych. U myszy natomiast dokonują tego transgeny. Dziedziczne mutacje mogą także powstawać na skutek retrowirusowej infekcji do komórek wczesnych zarodków mysich. Jeżeli retrowirus wbuduje się do genomu gospodarza w pobliżu jakiegoś genu, to funkcjonowanie tego genu jest zwykle zaburzone. Aktywność genu może zostać zablokowana, zredukowana lub wzmocniona. Wzmocnienie komórkowych onkogenów często prowadzi do rozwoju nowotworu.

W pierwszym pokoleniu myszy transgenicznych (czyli myszy, które rozwinęły się ze zmienionej zapłodnionej komórki jajowej) transgen będzie obecny tylko w jednym chromosomie z homologicznej pary (czyli tylko w jednym allelu miejsca „docelowego”). Dzięki krzyżówkom wsobnym można otrzymać więcej podobnych heterozygot oraz kilka homozygot. Zmienione cechy wykazują raczej myszy homozygotyczne pod względem transgenu, ponieważ oba allele są w nich zmienione i efekty mutacji mogą być widoczne. Jeśli zmiany takie stwierdza się, można sklonować zmutowany gen, nawet jeśli jest on całkowicie nie znany. Jest to możliwe dlatego, że wstawiony element zawiera przynajmniej jedną sekwencję DNA obcą dla genomu myszy – wektor użyty do sklonowania transgenu. Użycie sond molekularnych specyficznych wobec DNA wektora umożliwia więc wykrycie i odzyskanie z biblioteki genomowego DNA klonów zawierających zmieniony gen; klony takie często zawierają mysie sekwencje otaczające miejsce wbudowania się transgenu.

Jednym z przykładów ilustrujących użyteczność tej metody jest wykrycie genu odpowiedzialnego za prawidłowy rozwój kończyn tylnych myszy. Wstawienie transgenu w obrębie tego genu spowodowało defekt rozwoju przypominający zaburzenia rozwojowe, jakie stwierdzono przed ponad dwudziestu laty u myszy, u których wystąpiła spontaniczna mutacja. Dzięki przypadkowi ustalono, że miejscem docelowym insercji transgenu był allel owego genu, którego mutację znano od dawna. Sklonowano i zsekwencjonowano ten gen oraz odpowiedni cDNA. Podobne geny wykryto również w DNA człowieka i kury, prawdopodobnie więc odgrywają one bardzo istotną rolę w rozwoju kręgowców. Badania nad ekspresją tego genu oraz jego białkowym produktem rzucą światło na ten etap rozwoju. Inne mutacje spowodowane przez insercje wykryto w podobny sposób. Szczególnie ważna jest możliwość identyfikacji genów odgrywających istotną rolę w bardzo wczesnych etapach rozwoju. Mutacje w tych genach są zwykle letalne i prowadzą do usunięcia płodu na wczesnym etapie rozwoju. Niezależnie od trudności, jest bardzo prawdopodobne, że badania nad podobnymi mutacjami u myszy powiedzą nam wiele o najważniejszych stadiach rozwoju człowieka